Mikroskopi, histolojik bir görüntüyü yalnızca büyütmek değil, dokunun yapısını işleviyle ilişkilendirecek ayrıntıyı görünür kılmaktır. Bu rehber; ışığın davranışından merceklerin ayarına, özel ışık mikroskopisi yöntemlerinden elektron mikroskopisine kadar slaytlardaki kavramları görüntünün nasıl oluştuğu üzerinden çalıştırır.

1. Histolojinin amacı ve mikroskobik inceleme

Kaynak slaytlar: 1–4

1.1 Histoloji neyi inceler?

Histology hücreleri, dokuları ve bunların birbirleriyle ilişkisini inceler; görülen yapıyı hücrenin ya da organın işleviyle birlikte yorumlar. Bu nedenle yalnız “neye benziyor?” sorusu değil, “bu düzen ne işe yarıyor?” sorusu da önemlidir. Örneğin yüzeyi genişleten bir hücre uzantısını tanımak, o hücrenin emilim kapasitesini düşünmeye götürür. Slayttaki microscopical anatomy ifadesi, histolojinin morfoloji disiplini içinde, çıplak gözle görülemeyen anatomik ayrıntıları ele aldığını belirtir. Embriyoloji ise gelişim sürecini konu edinir; bu dersin mikroskopi araçları gelişen dokuların incelenmesinde de kullanılabilir.

Üniversitenin Histology and Embryology dersi için slaytta Junqueira’nın Basic Histology, Ross ve Pawlina’nın Histology, diFiore’nin atlası, Kierszenbaum’un Histology and Cell Biology, Sadler’in Langman’s Medical Embryology, Moore ve Persaud’un Human Embryology ve Alberts ve arkadaşlarının Molecular Biology of the Cell kaynak olarak sıralanır. Atlaslar görüntü tanımayı, histoloji kitapları yapı–işlev bağlantısını, embriyoloji kitapları gelişimsel bağlamı destekler. Bu liste tekniklerin kanıtı yerine geçmez; farklı ölçeklerde aynı yapının nasıl anlatıldığını karşılaştırmak için kullanılabilir.

1.2 Görüntüye giden iki temel iş

Histolojik yöntem iki karar içerir: uygun mikroskobu seçmek ve örneği ona uygun hazırlamak. Uygulama derslerinde konvansiyonel bright field light microscopy yani aydınlık alan ışık mikroskopisi temel yöntemdir. Canlı hücreyi, floresan işaretlemeyi veya hücre yüzeyinin ayrıntısını araştırırken başka düzenekler gerekir. Görüntü elde etme biçimi değiştikçe örnek hazırlığı da değişir: kalın, boyasız canlı hücre faz kontrastta incelenebilirken, elektronların geçebilmesi için TEM örneğinin çok ince olması beklenir.

Slaytın vurguladığı iki yaygın işlem kesit alma (sectioning) ve boyamadır (staining). Kesit, kalın doku içindeki üst üste binmeyi azaltır ve ışığın geçmesini sağlar. Boya, normalde birbirine yakın optik özellik gösteren yapılara farklı görünürlük kazandırır. Kesit düzlemi de yorumun parçasıdır: aynı tübüler yapı enine kesitte yuvarlak, boyuna kesitte uzun görünür. Bu yüzden tek bir iki boyutlu kesitten üç boyutlu şekle hükmederken komşu kesitler ve doku düzeni göz önünde tutulur.

2. Ölçek, ışık ve merceklerle görüntü oluşumu

Kaynak slaytlar: 5–10

2.1 Mikroskobik ölçeği okumak

Histolojide metrik birimler kullanılır. Milimetre (mm) 10⁻³ m, mikrometre (µm) 10⁻⁶ m, nanometre (nm) 10⁻⁹ m, ångström (Å) 10⁻¹⁰ m ve pikometre (pm) 10⁻¹² m’dir. Dolayısıyla 1 mm = 1000 µm, 1 µm = 1000 nm ve 1 nm = 10 Å. Bir hücrenin boyutu ile bir moleküler bağın boyutu aynı birimle verilirse sezgi zorlaşır; ölçek değişimi hangi yöntemin gerekli olduğunu da işaret eder. Örneğin mikrometre ölçeğinde hücre düzeni ışık mikroskobunda değerlendirilebilirken nanometre düzeyindeki ince yapı için elektron mikroskopisi gerekir.

Altıncı sayfadaki organlardan atomlara uzanan görsel, büyütmenin basit bir “yaklaştırma” işlemi olmadığını gösterir. Her ölçekte farklı yapılar öne çıkar: organın genel biçimi, dokuların dizilimi, hücreler, hücre içi bileşenler ve moleküller. Bir ölçekten diğerine geçerken yalnız büyütmeyi artırmak yetmez; yöntemin çözünürlüğü, yani iki yakın ayrıntıyı ayrı gösterebilme yeteneği de yeterli olmalıdır. Görseldeki basamaklar nicel bir ölçüm cetveli gibi değil, gözlem ölçeklerinin kavramsal haritası gibi okunmalıdır.

Bir görüntüdeki ölçek çubuğu, ekranda kaç santimetre yer kapladığından bağımsız olarak örnekte belirli bir uzunluğu temsil eder. Bu nedenle hücre boyutunu anlamak için sunumun büyütme yüzdesine veya fotoğrafın sayfadaki genişliğine bakılmaz. Aynı mikrograf farklı boyutlarda basılabilir; çubuk ve görüntü birlikte büyüdüğü için örneğin gerçek ölçüsü değişmez. Şemada “daha küçük” basamağa ilerlemek de yalnız sayıyı küçültmek değildir: sorulan biyolojik ilişki, örnek hazırlığı ve görüntüdeki anlamlı komşuluklar değişir.

2.2 Işık dalgası, yansıma ve kırılma

Işık elektromanyetik bir dalgadır. Slayt 7’de dalga boyu (λ), frekans ve elektromanyetik spektrum gösterilir. Görünür aralık, farklı dalga boylarının gözde farklı renkler olarak algılandığı bölgedir; optik mikroskopi bu dalgalarla çalışır. Işık bir yüzeye geldiğinde bir bölümü yansır (reflection), bir bölümü farklı ortama girerek yön değiştirir: buna kırılma (refraction) denir. Kırılma indisi, ışığın bir ortamda ne kadar yavaşladığını ve sınırda yolunun nasıl büküldüğünü anlamak için kullanılır. Hava–cam, cam–yağ gibi geçişlerde bu fark, objektife ulaşan ışınların dağılımını değiştirir.

Işık dalgaları üst üste geldiğinde girişim (interference) oluşur; dalgaların fazına göre şiddet artabilir veya azalabilir. Kırınım (diffraction) ise ışığın bir kenar ya da dar açıklık çevresinde yayılmasıdır. Slayt 9’daki dalga ve açıklık şeması bu iki olguyu bir arada düşündürür. Çok küçük iki noktanın görüntülerinin birbirine karışmasının temel nedenlerinden biri kırınımdır. Böylece çözünürlük sınırı, yalnız mercek kusurundan değil, ışığın dalga doğasından da kaynaklanır. Faz kontrast ve polarizasyon gibi yöntemlerin mantığı, ışık dalgasındaki görünmeyen farkları gözlenebilir şiddet farkına dönüştürmektir.

2.3 Dışbükey mercek ve sanal görüntü

Convex lens yani dışbükey mercek ışınları yakınsak hale getirir. Nesnenin merceğe göre konumu görüntünün gerçek ya da sanal olmasını belirler. Nesne odak uzaklığının içinde kaldığında ışınlar mercekten sonra ayrılarak çıkar; göz bu ışınların geriye uzantılarını aynı tarafta birleşiyormuş gibi algılar. Oluşan sanal görüntü (virtual image) büyüktür ve doğrudan ekrana düşürülemez. Slayt 10’daki ışın çizimi, okülerin büyütülmüş ara görüntüyü göz için nasıl sunduğunu anlamaya yarar. Bir mikroskopta objektif ilk görüntüyü, oküler ise gözün algıladığı son görüntüyü oluşturur; bu iki görevi karıştırmamak gerekir.

3. Işık mikroskobunun düzeni ve görüntü kalitesi

Kaynak slaytlar: 11–18

3.1 Işığın izlediği yol ve mikroskop tipleri

Konvansiyonel aydınlık alan mikroskobunda slayt, ortalama dalga boyu yaklaşık 550 nm alınan tungsten–halojen lamba örneği verir. Işık kaynağı örneği alttan aydınlatır. Kondansör (condenser) kaynaktan gelen ışığı toplayıp preparata yönlendirir; objektif (objective lens) örneğin ilk büyütülmüş görüntüsünü oluşturur; oküler (ocular lens) bu görüntüyü göz için yeniden büyütür. Slayt 12’deki düzenek çiziminde ışık, alttaki kaynak ve kondansörden preparata, ardından döner tabladaki objektife ve okülere ilerler. Mekanik tabla preparatın alanını değiştirir; odaklama düğmeleri örnek–objektif uzaklığını ayarlar. Alan diyaframı ve kondansör, aydınlatmanın biçimini kontrol eder.

Slayt 13’teki inverted microscope yani ters mikroskopta objektifler örneğin altında bulunur. Böyle bir düzen, kap içindeki hücreleri kap tabanından izlemeye uygundur. “Ters” sözcüğü görüntünün baş aşağı görünmesini değil, optik bileşenlerin ve örneğin yerleşimindeki farkı anlatır. Konvansiyonel düzenekte preparat, objektifin altındadır; ters düzende kültür kabı genellikle objektifin üstündedir. Bu ayrım, yaşayan hücreyi kap içinde, hazırlığı bozmadan izleme ihtiyacından doğar.

3.2 Büyütme, çözünürlük ve sayısal açıklık

Toplam büyütme oküler büyütmesi ile objektif büyütmesinin çarpımıdır. Slaytın örneği: 5× oküler ve 40× objektif, 200× toplam büyütme verir. Ancak büyütülen görüntüde yeni ayrıntı üretilmez. Çözünürlük (resolution) iki noktayı iki ayrı görüntü olarak seçebildiğimiz en küçük uzaklıktır. Bu uzaklık küçüldükçe çözünürlük iyileşir. Slaytta çıplak göz için 200 µm, ışık mikroskobu için yaklaşık 0,2 µm, SEM için 0,2 nm ve TEM için teorik 0,05 nm gibi karşılaştırma sayıları bulunur. Bunlar slayttaki örnek değerlerdir; gerçek başarım aygıt ve preparata göre değişir. TEM bölümünde bu sınırlamayı yeniden değerlendireceğiz.

Kısa dalga boyunun daha küçük ayrıntıları çözmeye yardım etmesi, kırınım sınırıyla ilişkilidir. Buna karşılık çözünürlük yalnız dalga boyuna bağlı değildir. Numerical aperture (NA) objektifin ışık toplama yeteneğini ifade eder ve slayttaki gibi NA = n sinθ biçiminde yazılır. Burada n, preparat ile objektif arasındaki ortamın kırılma indisi; θ, objektifin kabul ettiği ışık konisinin yarı açısıdır. Daha büyük açı daha çok ışın ve daha ince ayrıntı bilgisi demektir. Slayt 18’de verilen yaklaşık çözünürlük ilişkisi, dalga boyu ile NA’nın birlikte rol aldığını gösterir: λ küçüldüğünde veya NA arttığında ayırt edilebilir uzaklık azalır.

İmmersiyon yağı camla objektif arasındaki hava boşluğunu farklı kırılma indisli bir ortamla değiştirir. Slayt 17’de havada geniş açıyla çıkan kimi ışınların objektife giremediği, yağla daha çok ışının toplandığı gösterilir. Bu, yüksek NA ve daha iyi çözünürlük için önemlidir. Yağ kullanımı merceği keyfî biçimde güçlü yapmaz; amaç ışın kaybını ve kırılmayı uygun biçimde yönetmektir. Objektifin tasarımı da yağ kullanımına uygun olmalıdır. Slayt 16’nın çalışma uzaklığı çizimi, yüksek açıyla ışın toplayan objektifin preparata yaklaşması gerektiğini hatırlatır. Kısa çalışma uzaklığı odaklamada dikkat ister.

Slayt 18’in mercek ve nokta görüntüsü çiziminde iki yakın noktanın neden tek bulanık leke gibi algılanabileceği görülür. Her nokta optik sistemde kusursuz matematiksel nokta olarak değil, kırınım nedeniyle belli bir genişliğe yayılmış görüntü olarak oluşur. İki yayılım fazla örtüşürse sınır seçilemez. Görüntüyü daha büyük ekrana taşımak bu örtüşmeyi ayırmaz; daha kısa dalga boyu ve daha büyük NA fiziksel ayırım olasılığını değiştirir. Kontrast ise bu ayrılmış yapıların göz tarafından ne kadar kolay seçileceğini etkiler. Böylece “görüntü net”, “görüntü kontrastlı” ve “yüksek çözünürlüklü” ifadeleri yakın görünse de ayrı ölçütleri anlatır.

Slayt 12’nin çizimindeki revolver objektif yuvası farklı büyütmedeki objektifler arasında geçiş sağlar. Düşük büyütmede geniş alanı tarayıp ilgili bölgeyi bulmak, sonra daha yüksek objektife geçmek mantıklıdır. Yüksek objektife geçildiğinde görüş alanı daralır ve çalışma uzaklığı değişebilir. Bu yüzden preparatın konumunu ve odağını yeniden kontrol etmek gerekir. Slayt 13’teki ters mikroskobun başlıca yararı ise kap içindeki hücrelere erişimdir; aynı büyütme ve çözünürlük ilkeleri bu düzende de geçerlidir. “Ters” terimi ayrı bir fizik yasası değil, örnek–objektif geometrisini tanımlar.

4. Mikroskobu ayarlamak: odak ve Köhler aydınlatması

Kaynak slaytlar: 19–22

4.1 Görüntüdeki kusur nereden gelir?

Slayt 19 bir mikroskobun preparat ve objektif çevresinde elle kullanıldığını gösterir; slayt 20 aydınlık alan düzenini görsel olarak hatırlatır. Bu kısa sayfaların pratik mesajı şudur: örneği bulmak, odaklamak ve aydınlatmayı ayarlamak birbirinden ayrı işlemlerdir. Önce preparatın ilgili bölgesi tablayla görüntü alanına getirilir; ardından odak düğmesiyle netlik sağlanır. Odak doğru olsa bile aydınlatma eşit dağılmıyorsa kenarlar karanlık, merkez aşırı parlak olabilir. Böyle bir görüntüde doku farkı sandığımız şey ışık düzeninin kusuru olabilir.

Köhler illumination ışık kaynağının görüntüsünü doğrudan örneğin üstüne düşürmeden, alanı eşit ve denetlenebilir biçimde aydınlatmak için kullanılan ayardır. Slayt 21 adımları sıralar: örneği odakla; alan diyaframını kapat; kondansörü alan diyaframının çokgen kenarı keskin görünene kadar odakla; bu şekli merkeze al; sonra alan diyaframını aç. Slayt 22 aynı işlemi video kapağıyla anımsatır. Adımların sırası önemlidir: önce örnek odakta değilse diyafram kenarının keskinliği doğru değerlendirilemez, merkezleme yapılmadan diyafram açılırsa eşit aydınlatma beklenmez.

4.2 Alan diyaframı ile kondansörün rolü

Alan diyaframı ışığın örnek üzerindeki aydınlatılan alanını sınırlar. Kapatıldığında görüntüde belirgin bir sınır görünür; bu sınır hem kondansörün odağını hem merkezini ayarlamak için işaret olur. Kondansörün yüksekliğini değiştirmek, diyafram kenarının preparat düzleminde keskinleşmesini sağlar. Merkezleme vidaları kenarı görüntü alanının ortasına taşır. Diyafram yeniden açılırken aydınlatılan alanın görüş alanını kaplayacak kadar geniş olması gerekir. Gereğinden fazla açık bırakmak istenmeyen ışık ve düşük kontrast yaratabilir. Kondansör açıklığı ise ışık konisini etkileyen ayrı bir ayardır; alan diyaframıyla eş anlamlı değildir.

5. Aydınlık alan, karanlık alan ve faz kontrast

Kaynak slaytlar: 23–30

5.1 Işık mikroskopisi yöntemleri haritası

Slayt 23, yedi yöntemi sayar: conventional bright field, dark field, phase contrast, polarized light, fluorescence, interference ve confocal laser microscopy. Bunlar aynı optik mikroskop ailesinde yer alsa da görüntüdeki farklılık farklı fiziksel kaynaklardan gelir. Bu bölüm ilk üçünü karşılaştırır; polarizasyon, floresans ve konfokal yöntemler sonraki bölümlerdedir. Listede altıncı sıradaki interference microscopy için ayrı açıklayıcı slayt bulunmaz. En temel düzeyde, örnekten geçen ışık dalgalarının faz farklarını karşılaştırarak yoğunluk farkı elde eden optik yöntem ailesidir. Faz kontrastla aynı sözcükleri paylaşması, iki tekniğin tamamen özdeş olduğu anlamına gelmez.

Aydınlık alan (bright field) histoloji ve histopatolojide yaygındır. Slayta göre yarı saydam örneğin tüm alanı aydınlatılır. Boyanmış kesitte ışığın farklı bölgelerde farklı tutulması ya da geçirilmesi kontrast sağlar; açık arka plan üzerinde hücre ve doku bileşenleri görülür. Boyasız, çok saydam canlı hücrede kontrast zayıf kalabilir. Yöntemin yaygınlığı, rutin kesitlerle güçlü bir eşleşmesinden gelir; her biyolojik soruya tek başına yeterli olmasından değil.

5.2 Karanlık alan: saçılan ışığı seçmek

Dark field microscopy özel bir kondansörle merkezden gelen doğrudan ışığı engeller. Örneğe eğik gelen ışık, örnek tarafından saçılmadıkça objektife girmez. Bu yüzden arka plan karanlık, saçıcı yapılar parlak görünür. Slayt 24 yöntemi otoradyografi ve mikrobiyolojiyle ilişkilendirir; slayt 25 ışık yolunu şemalaştırır. Slayt 26’daki parlak noktalar ve hücre konturları, ince parçacıkların karanlık zemin üzerinde seçilmesini gösterir. Burada parlaklık otomatik olarak daha büyük yapı anlamına gelmez; ışık saçma yeteneği de görüntüyü etkiler. Saçılan ışığı vurgulamak sınırları görünür kılar, fakat iç yapıyı tek başına tam olarak açıklamaz.

5.3 Faz kontrast: saydam hücreyi canlı izlemek

Phase contrast microscopy Frits Zernike’nin geliştirdiği ve slaytta 1953 Nobel Ödülü ile anılan yöntemdir. Canlı, boyasız hücrelerde su ile sitoplazmik bileşenlerin kırılma indisi farkı ışığın fazını değiştirir. Göz faz farkını doğrudan algılamaz; özel kondansör ve objektif optiği bu farkı aydınlık–karanlık yoğunluk farkına dönüştürür. Slayt 28 faz kontrast kondansörünü, slayt 29 aynı canlı hücrelerin aydınlık alan ve faz kontrast görünümünü karşılaştırır. İkinci görüntüde sınırlar ve iç ayrıntılar daha belirgin görünür. Bu, boya kullanılmadığı halde görüntü elde edilebilmesinin nedenidir; “canlı” sözcüğü bütün faz kontrast örneklerinin mutlaka canlı olduğu iddiası değildir.

Slayt 30, faz kontrast altında “Bacillus antharasis” yazılı bir mikrobiyoloji örneği verir. Görseli burada teknik örnek olarak kullanmak yeterlidir: saydam bakteriyel şekiller faz kontrastla belirginleşir. Tür adının yazımı son bölümde doğrulanmıştır. Aynı görüntüde farklı kalınlıktaki hücreler, farklı faz kaymaları üretebilir; bu nedenle faz kontrast görüntüsündeki parlak/koyu tonları kimyasal boya yoğunluğu gibi okumamak gerekir.

Üç yöntemi aynı canlı kültür üzerinde düşünmek seçim mantığını keskinleştirir. Aydınlık alanda boyasız hücrenin sınırı arka plana yakın tonda kaldığında hücreyi bulmak güçleşir. Karanlık alana geçildiğinde hücre kenarından saçılan ışık belirginleşebilir, fakat ince iç yapıların kontrastı her zaman yeterli olmaz. Faz kontrastta ise hücre içindeki farklı optik yolların yarattığı faz kayması da görüntüye katkı verir. Bu, özellikle hücre hareketi, biçim değişimi ve çoğalmasını izlerken yararlıdır. Hangi yöntemin seçileceği “en parlak” görüntüye değil, araştırılan yapıya bağlıdır.

Slayt 25’te ışık konisinin merkezinin durdurulması, karanlık alanın temel düzenek farkını açıklar. Doğrudan ışık objektife ulaşsaydı arka plan da aydınlanır ve zayıf saçıcı parçacıkların kontrastı azalırdı. Slayt 26’daki ince parlak parçacıkları yorumlarken görünen noktanın boyutunu doğrudan parçacığın fiziksel çapı sanmamak gerekir; optik görüntüde kırınım ve saçılma görüntünün görünür genişliğini etkiler. Buna karşılık faz kontrast kondansörü, doğrudan ve örneğin etkilediği ışığın faz ilişkisini kullanır. Her iki düzende de kondansör özel görev üstlenir ama yaptığı iş aynı değildir.

İnterferans mikroskopisi listede ad olarak bulunduğu için onu da konumlandırmak gerekir: iki ışık yolunun ya da dalga bileşeninin faz ilişkisi kullanılarak optik kalınlık farkları görünür hale getirilebilir. Slayt bu yöntemin özel düzeneklerini veya örneklerini vermediğinden ayrıntılı protokol çıkarmak doğru olmaz. Öğrenme düzeyinde, faz kontrast ve interferansın ikisinin de saydam örnekteki faz/optik yol bilgisinden yararlandığını, aydınlık alanın ise çoğunlukla doğrudan geçirgenlik farkına dayandığını ayırmak yeterlidir.

6. Polarize ışık mikroskopisi

Kaynak slaytlar: 31–37

6.1 Polarizasyon ve cihaz düzeni

Sıradan ışığın elektrik alanı birçok düzlemde titreşir. Düzlem polarize ışık (plane-polarized light) ise seçilmiş bir titreşim düzlemine sahiptir. Slayt 31’de iki polarizörlü şema bunu gösterir: ilk polarizör ışığı tek düzleme seçer; ikinci polarizör, birincisine dik yerleştirilirse değişmemiş ışığı geçirmez. Örnek araya konduğunda bazı maddeler ışığın polarizasyon durumunu değiştirir ve ikinci polarizörden ışık geçebilir. Bu ilke, neden bazı yapıların koyu zeminde parlak ya da renkli göründüğünü açıklar.

Polarized light microscope, slayt 32’ye göre optik olarak anizotropik örnekleri incelemek ve fotoğraflamak için tasarlanmıştır. Anizotropi, maddenin ışığa etkisinin yönle değişmesi demektir. Işık yolunda örnekten önce bir polarizer, objektif ile gözlem yolu arasında ikinci bir polarizör olan analyzer bulunur. Slayt 33’te modern cihazda dönebilen polarizör, analizör ve tabla gösterilir. Tabla veya analizörün çevrilmesi ışığın örnek içindeki yönünü değiştirir; aynı yapı farklı konumlarda farklı parlaklık verebilir. Bu yüzden karanlık görünüm tek başına “yapı yok” anlamına gelmez.

6.2 Çift kırılma ve örnek görüntüler

Birefringence ya da çift kırılma, ışığın örnekte karşılıklı dik düzlemlerde kutuplanmış iki bileşene ayrılmasıyla ilgilidir. Slayt 34 kontrastı, düzlem polarize ışığın böyle bir örnekle etkileşmesine bağlar. Bileşenler farklı hızlarda ilerleyerek faz farkı kazanır; analizörde yeniden bir araya geldiklerinde parlaklık veya renk farkı oluşturabilir. Renkler yalnız pigmenti göstermez: örneğin kalınlığı, optik özelliği ve yönelimi de etkili olabilir. Slayt 35 ve 36’daki örgülü, halka benzeri doku görünümleri yönlü yapıların örnekleri olarak okunabilir; görüntüdeki desenin kaynağı, düzenli yerleşimin polarize ışıkla etkileşimidir. Slayt 37 DMT kristallerinde yüksek dereceli girişim renklerini ve değişik büyüme biçimlerini gösterir. Kristal görüntüsü bir histolojik tanı örneği değil, yöntemin optik davranışını sergileyen örnektir.

Polarize ışık yöntemi, normal aydınlık alanda benzer görünen düzenli ve düzensiz yapıların ayrılmasına yardım eder. Ancak kesit yönü önemlidir: anizotropik bir yapının optik ekseni ışığa göre farklı konumdayken görünümü değişebilir. İki polarizörün dik olması da yorumun parçasıdır. İlk polarizörü çıkarıp yalnız analizörle aynı kontrastı beklemek doğru değildir; yöntem ışığın önce seçilmesini, örnekten geçmesini, sonra yeniden seçilmesini gerektirir.

Slayt 31’in dik polarizörlerini örneksiz düşündüğümüzde ikinci elemandan ışık geçişi en aza iner; bu durum çapraz polarizörler için başlangıç karanlığıdır. Araya anizotropik yapı girdiğinde ışığın titreşim bileşenleri farklı yol alır ve analizörün geçirebileceği bir bileşen oluşabilir. Böylece karanlık zemindeki parlaklık, yalnız örneğin ışığı “daha güçlü” geçirdiğini değil, kutuplanma durumunu değiştirdiğini anlatır. Yöntem, doğrudan bir boyanın bağlanma haritası gibi okunmamalıdır. Bir kristal, düzenli lif veya katmanlı yapı farklı açıyla yerleştirildiğinde aynı bileşimin farklı görünmesi mümkündür.

Slayt 35 ve 36’da halka çevresinde ve uzanan şeritler boyunca değişen tonlar, düzenin mikroskop görüntüsüne nasıl yansıdığını gösterir. Bu iki görselden tek başına kimyasal bileşim çıkarılamaz; slaytta da etiketli molekül tanımı verilmez. Öğrencinin burada izlemesi gereken ilişki, yönlü mikroyapının ışıkla etkileşimi ile görüntüdeki ton desenidir. Slayt 37’nin kristal örneğinde görülen parlak mavi ve yeşiller de aynı nedenle hazırlanma, kalınlık ve yönelime bağlı girişim renkleridir. Bir örneğin farklı yerinde farklı renk olması zorunlu olarak farklı madde bulunduğu anlamına gelmez.

7. Floresans ve immünofloresans mikroskopisi

Kaynak slaytlar: 38–43

7.1 Floresansın optik yolu

Fluorescence microscopy, görüntüyü örnekten saçılan ya da soğurulan aydınlatma ışığıyla sınırlamayıp floresans yayımı üzerinden kurar. Slayt 38, en basit epi-floresans düzeninden optik kesit alan konfokal düzene kadar floresans kullanan bütün mikroskopları bu başlık altında sayar. Fluorophore belirli dalga boyundaki uyarma (excitation) ışığını soğurur, ardından daha uzun dalga boyunda yayım (emission) yapar. Bu dalga boyu farkı, uyarma ışığını yayım ışığından ayırmayı mümkün kılar. Floresan etiket yalnız işaretlediği molekülü gösterecek biçimde seçildiğinde görüntü “nerede?” sorusuna yanıt verir; ışığın kendisi molekül kimliğini doğrulamaz.

Slayt 39’daki epifluorescence düzende uyarma ışığı örneğe objektiften gider, yayılan ışık aynı objektifle toplanarak dedektöre yönlendirilir. Slayt 40 şemasında uyarma filtresi, ışık ayırıcı ayna ve yayım filtresi ışık yollarını ayırır. Objektif hem uyarma hem toplama yolu olduğundan yüksek NA, daha çok yayılan fotonun toplanmasına ve ayrıntının görünmesine yardımcı olur. Ancak güçlü uyarma ışığı, arka plan floresansı veya sinyal sönmesi gibi görüntüleme sorunları da oluşturabilir. Çok renkli görüntülerde renkler kullanılan farklı fluoroforların kanallarıdır; doku doğal olarak aynı parlak renklerde olmak zorunda değildir.

7.2 Molekülleri işaretleme: boyalar ve antikorlar

Slayt 41 biyolojik floresan boyaları iki grupta örnekler. Küçük, kendisi floresan moleküller biyolojik hedefe bağlanabilir: DAPI ve Hoechst DNA/çekirdek boyaları olup slaytta UV uyarımlı; DRAQ5 ve DRAQ7 kırmızı ışıkla uygun uyarılan DNA boyaları olarak verilir. Boyanın hedefi DNA olsa bile bağlanma mekanizması bütün boyalar için aynı kabul edilmemelidir; ilgili slayt ifadesi son bölümde doğrulanmıştır. Diğer örnek, floresan işaret eklenmiş hedefe bağlanan moleküldür: phalloidin, aktin liflerini işaretlemek için kullanılır. Böylece çekirdek ile hücre iskeletinin ayrı kanallarda görünmesi, hücre içi yerleşimi karşılaştırmayı sağlar.

Immunofluorescence yönteminde antikorun antijene özgül bağlanması kullanılır. Önce hedef proteine bağlanan primary antibody uygulanır. Floresan etiket primer antikora doğrudan bağlıysa direkt immünofloresans elde edilir. Alternatif olarak primer antikoru tanıyan floresan bağlı secondary antibody kullanılır; bu indirekt immünofloresanstır. Slayt 42’de farede üretilmiş anti-tübülin primer antikor ve onu tanıyan floresan anti-fare sekonder antikorla mikrotübül işaretleme örneği verilir. Sekonder antikor hedef olan tübüline doğrudan değil, primer antikora bağlanır. Slayt 43’teki fibroblast görüntüsü çok renkli hücresel işaretlemenin örneğidir; renkli lifler ile çekirdeklerin dağılımı aynı hücre alanında birlikte okunur.

Bir floresan görüntü yorumlanırken üç düzey ayrılır. İlk düzey hedef seçimidir: boya DNA’ya, phalloidin aktine veya primer antikor seçilmiş proteine bağlanır. İkinci düzey ışık seçimidir: uygun dalga boyuyla uyarılmayan fluorofor parlak görünmez; filtre yanlışsa yayılan sinyal dedektöre ulaşmaz. Üçüncü düzey mekânsal yorumdur: parlak pikseller işaretin konumunu destekler, fakat başka bir renk kanalına yakın görünmesi tek başına iki molekülün doğrudan bağlandığını kanıtlamaz. Slayt 43 gibi birleşik görüntüler, farklı kanalları aynı hücre anatomisi içinde karşılaştırmak için değerlidir.

8. Konfokal lazer mikroskopisi

Kaynak slaytlar: 44–47

8.1 Noktasal tarama ve optik kesit

Confocal laser scanning microscopy (CLSM) slayt 44’te örneği fiziksel olarak kesmeden optik düzlemler oluşturan teknik olarak tanıtılır. Örnek yerinde kalır; farklı derinliklerden görüntü tekrar tekrar alınabilir. Slayt 45’teki laser scanning, bütün alanı aynı anda aydınlatmak yerine lazerle noktadan noktaya tarama demektir. Her noktanın sinyali uygun konuma yerleştirildiğinde bir görüntü düzlemi oluşur. Derinlik değiştirilerek bir dizi optik kesit elde edilir; bu kesitler üç boyutlu düzeni yorumlamaya yardımcı olur. Bu işlem kesici bıçakla fiziksel kesit almak değildir, bu nedenle örnek bütünlüğü korunur.

Slayt 46’daki optik düzende lazer örnekte seçilmiş bir odak düzlemini uyarır. Dönen sinyal ışık ayırıcıdan geçer ve dedektör önündeki pinhole adlı küçük açıklığa gelir. Odak dışından gelen yaygın ışığın önemli bölümü bu açıklıktan geçemez; odak düzleminden gelen ışık ağırlık kazanır. Böylece kalın örnekte üst ve alt düzlemlerin bulanıklığı azalır. Slayt 47, geniş alan ışık mikroskobu ile konfokal düzende toplanan ışığı ve odak derinliğini karşılaştırır: geniş alanda örneğin farklı katlarından sinyal birbirine eklenebilirken konfokalde belirli düzlem seçilir. Konfokal görüntüde arka planın azalması ile çözünürlüğün artması aynı kavram değildir; bu ayrım son bölümde de belirtilir.

8.2 TEM ile hangi farklar sorulur?

Slayt 44, konfokal yöntemi elektron mikroskobuyla karşılaştırır: elektron mikroskobuna kıyasla daha düşük çözünürlük, fakat daha az örnek hazırlığı ve canlı örneğin üç boyutlu izlenebilmesi. Bu karşılaştırma “hangi mikroskop daha iyi?” sorusundan çok “hangi biyolojik olay izlenecek?” sorusuyla ilgilidir. Hücrelerin zaman içindeki hareketi, etiketli bir proteinin dağılımı veya doku tabakasındaki konum değişimi araştırılıyorsa canlı görüntüleme değerlidir. Çok küçük ultrastrüktürel ayrıntı soruluyorsa TEM uygundur; fakat hazırlık ve vakum koşulları aynı canlı sürecin kesintisiz izlenmesine elvermez.

Konfokal yöntem çoğu zaman floresan sinyalle birlikte kullanılır; slayt 38’in konfokali floresan mikroskop ailesine dahil etmesi bu yüzdendir. Bununla birlikte floresans, işaretin nasıl ışık yaydığını; konfokal ise sinyalin hangi hacimden seçilerek toplandığını anlatır. Bir görüntünün “floresan” olması otomatik olarak “konfokal” olduğu anlamına gelmez. Aynı antikor işaretlemesi geniş alan epi-floresans veya konfokal düzende okunabilir; optik kesit ve bulanık arka plan açısından sonuç değişir.

9. Elektron mikroskobunun ilkeleri ve TEM

Kaynak slaytlar: 48–54

9.1 Işıktan elektron demetine geçiş

Electron microscopy (EM) ışık yerine elektron demeti kullanır. Slayt 48’in vurgusu, elektronların dalga boyunun görünür ışığa göre çok kısa olması ve bu nedenle daha ince ayrıntının çözülebilmesidir. Görünür ışık için 397–723 nm, örnek elektron demeti için 0,005 nm yazılır. Mercek işlevi camla değil, elektronların elektromanyetik alanda saptırılmasıyla gerçekleşir. Bu, mikroskobun yalnız daha büyük görüntü üretmesi değil, ışık mikroskobunun seçemediği ayrıntı ölçeğine inmesi demektir. Slaytta yer alan “400 times more magnification” ifadesi ile farklı TEM çözünürlük sayıları, bağlama bağlı okunmalıdır; kaynaklı açıklama son bölümdedir.

Slayt 49 iki ana türü ayırır: transmission electron microscopy (TEM) ve scanning electron microscopy (SEM). TEM’de elektronların örnekten geçişi incelenir; SEM’de demet yüzeyi tarar ve yüzeyden çıkan sinyaller toplanır. İki kısaltma aynı nesnenin iki farklı fotoğraf filtresi değildir. Örnek hazırlığı, elektronların örnekle etkileşimi ve yanıtlanan yapısal soru değişir. Slayt 53’teki çift cihaz şeması bu farkı gösterir: TEM kolonunda örnekten geçen elektronlar alt görüntü düzlemine ilerler; SEM’de yüzeyden çıkan elektronlar yandaki dedektöre gider.

9.2 TEM kolonu ve kontrast

TEM’de elektron tabancasından çıkan demet vakumlu kolon boyunca ilerler. Slayt 50, katot–anot arasında 60–100 kV gerilim farkını, kondansör elektromanyetik merceklerin demeti örneğe odaklamasını ve objektif/projektör merceklerin görüntüyü büyütmesini anlatır. Görüntü floresan ekrana veya başka algılayıcıya yönlendirilebilir. Vakum, elektronların hava molekülleriyle çarpışmasını azaltır; aksi halde hedefe düzenli demet ulaşmaz. Çok ince örnek elektron geçişi için gereklidir. Slayt 15’te “1 nm tissue section” ifadesi yer alır; bu da TEM için genel kesit kalınlığı olarak güvenle alınmamalıdır, çünkü tek bir sayıyla tüm preparatlar tarif edilemez.

Slayt 51’e göre elektronların bir bölümü örnek tarafından saçılır, bir bölümü daha doğrudan geçer. Daha çok saçan yoğun bölgeler daha koyu; daha az saçan alanlar daha açık görünür. Buradaki “yoğun” sözcüğünü yalnız doku sertliği ya da hücrenin doluluğu olarak okumamak gerekir: preparatın kalınlığı ve elektronlarla etkileşen madde miktarı da kontrastı etkiler. TEM görüntüsü hücre içi ince yapıyı iki boyutlu bir kesitte gösterir. Slayt 52 TEM’nin kolon düzenini, slayt 54 ise glycocalyx ve microvilli etiketli bir örneği gösterir. Mikrovilluslar apikal yüzeyin parmak benzeri uzantıları, glikokaliks bu yüzeyde görülen hücre dışı örtüdür. Kesitte yan yana uzantıların görülmesi, yüzeyin genişlediğini düşündürür; etiketli görsel TEM’nin hangi düzeyde ayrıntı sağladığını somutlaştırır.

TEM ile elde edilen açık–koyu dağılım, boyalı ışık mikroskobu kesitindeki renklerden farklı bir kontrast dilidir. Slayt 54’ün mikrovilluslarını izlerken bir uzantının sınırını, komşu uzantı arasındaki boşluğu ve üzerindeki glikokaliks örtüsünü ayrı ayrı tanımak gerekir. Aynı yapının yüzeyden görüntülenmesi hâlinde çıkıntıların dış biçimi öne çıkardı; TEM kesiti ise sınırların ve iç komşulukların düzenini gösterir. Bu, TEM–SEM seçiminin neden yalnız çözünürlük sayısına indirgenemeyeceğini açıklar. Görüntüdeki bir karanlık çizginin gerçek zar mı yoksa kesit yönünün sonucu mu olduğunu anlamak için çevresindeki düzeni birlikte okumak gerekir.

Slayt 50’nin 60–100 kV bilgisi, elektronları hızlandıran potansiyel farkının bu sunumda verilen bir çalışma aralığı olduğunu gösterir. Hızlandırma gerilimi elektronların demet özelliklerini ve örnekle etkileşimini etkiler; tek başına “daha yüksek gerilim her zaman daha iyi biyolojik görüntü” kuralı çıkarılmaz. Vakum, elektromanyetik mercekler ve çok ince kesit birlikte çalışır: elektronlar yolda dağılmadan örneğe varmalı, örneğin yeterli kısmından geçmeli ve çıkıştaki dağılım görüntüye dönüştürülmelidir. Bu zincirdeki herhangi bir sınır sonuç görüntünün yararlı ayrıntısını azaltır.

10. SEM ve yüzey topografyası

Kaynak slaytlar: 55–59

10.1 Taramalı elektron görüntüsünün oluşumu

Scanning electron microscopy (SEM) slayt 55’e göre hücre ve dokuların üç boyutlu algılanan topografik görüntüsünü verir. Birincil elektron demeti metal kaplanmış örneğin yüzeyiyle etkileşir; yüzeyden çıkan daha düşük enerjili elektronların toplanması görüntüyü oluşturur. Buradaki “3D” ifadesi, çoğu SEM görüntüsünün derinlik hissi güçlü bir yüzey görünümü olduğunu anlatır; tek resim otomatik olarak tüm hacmin ölçülmüş üç boyutlu haritası değildir. Sinyal örneğin yüzeyi ve yüzey geometrisiyle bağlantılıdır. Bu nedenle SEM, iç organellerin ince kesitteki yerleşimini göstermekten çok dış biçim, çıkıntı, çukur ve yüzey örgüsünü gösterir.

Slayt 56’daki SEM şeması elektron tabancası, kondansör, tarama bobini ve dedektörü bir yol üzerinde gösterir. Elektron demeti yüzey boyunca satır satır yönlendirilir; her konumda ölçülen sinyal o konumun piksel parlaklığına bağlanır. Yüksek vakumlu çalışma ve kaplama, slaytın anlattığı geleneksel düzenin hazırlık adımlarıdır. Slayt 57’de farklı biçimli polen yüzeyleri, tekniğin yüzey oyuklarını ve çıkıntılarını nasıl belirginleştirdiğini gösterir. Slayt 58’de “Kalp” etiketli fotoğraf, lifsi çevre ve tübüler görünümle daha geniş doku yüzeyini gösterir; ölçek çizgisi 10 µm’dir. Görüntüdeki biçimi ölçerken 10 µm çubuğu kullanılmalı, ekranda fotoğrafın büyüklüğüne güvenilmemelidir.

10.2 TEM ile seçimi ve son karşılaştırma

Slayt 59, ışık mikroskobu, TEM ve SEM yollarını tek diyagramda karşılaştırır. Işık mikroskobunda ışık kaynağı ve cam mercekler; TEM’de elektron kaynağı, elektromanyetik mercekler ve örnekten geçen demet; SEM’de ise yüzeye yönlenen tarama demeti ile elektron dedektörü bulunur. Aynı görüntü konusu üç yöntemle farklı sorulara dönüşür: dokuların genel dizilimi ışık mikroskobunda, hücre içi zar ve organel ilişkisi TEM’de, dış yüzey biçimi SEM’de değerlendirilir. Bu yüzden yöntem adı görüntünün ölçeğinden başka hangi yüzün veya kesitin örneklendiğini de bildirir.

Slayt 55’in metal kaplama vurgusu, SEM görüntüsünün doğrudan doğal yüzeyin fotoğrafı gibi okunmaması gerektiğini de hatırlatır. Hazırlık; kurutma, kaplama ve vakum koşullarıyla yüzeyin görünümünü etkileyebilir. Slaytın amacı bu ayrıntıların protokolünü öğretmek değil, yüzeyden gelen elektron sinyalinin nasıl topografik bir görünüm sağladığını tanıtmaktır. Görüntüde koyu alanlar yalnız daha az madde içerdiği için koyu değildir; yüzey eğimi ve dedektöre ulaşan elektron miktarı da parlaklığı belirler.

Hızlı tekrar

20 özgün çalışma sorusu

Bu sorular çalışma amacıyla özgün olarak hazırlanmıştır; çıkmış sınav soruları değildir.

1. Boyasız, canlı ve çok saydam hücrelerin sınırlarını belirgin görmek için hangi yöntem en uygundur? A) TEM · B) Faz kontrast · C) SEM · D) Aydınlık alan · E) Polarize ışık
2. 5× oküler ve 40× objektifle toplam büyütme kaçtır? A) 8× · B) 45× · C) 200× · D) 400× · E) 2000×
3. Bir görüntü iki yakın noktayı ayırt edemiyorsa oküler büyütmesini artırmanın temel sınırı nedir? A) Kırılma indisi sıfırlanır · B) Gerçek ayrıntı üretilmez · C) Boya kaybolur · D) Objektif ışık yayar · E) Örnek kendiliğinden incelir
4. Köhler ayarında örnek odaklandıktan sonraki adım hangisidir? A) Sekonder antikor eklemek · B) Alan diyaframını kapatmak · C) Objektife yağ sürmek · D) Preparatı kesmek · E) Pinhole kapatmak
5. NA = n sinθ formülünde n neyi ifade eder? A) Oküler sayısını · B) Çalışma süresini · C) Ortamın kırılma indisini · D) Dalga frekansını · E) Kesit kalınlığını
6. Karanlık alan görüntüsünde parlak yapıların temel nedeni nedir? A) Doğrudan ışığın tamamı geçer · B) Elektronlar geçer · C) Örnek ışığı objektife saçar · D) Antikor yayım yapar · E) Polarizör ışığı boyar
7. 0,2 µm kaç nanometredir? A) 0,02 · B) 2 · C) 20 · D) 200 · E) 2000
8. Polarize ışık mikroskobunda analizör nereye yerleştirilir? A) Örnekten önce ilk filtre olarak · B) Örnekten sonra gözlem yoluna · C) Yalnız elektron tabancasına · D) Preparatın içine · E) Kondansör yağının yerine
9. Bir preparat döndürüldüğünde polarize ışıkta parlaklığı değişiyorsa hangi özellik öne çıkar? A) Yön bağımlı optik davranış · B) Tüm hücrelerin ölmesi · C) DNA’nın yokluğu · D) Kesitin kalınlığının sıfır olması · E) Elektron geçişi
10. Fare anti-tübülin primerini kullanan indirekt immünofloresansta floresan sekonder neyi tanımalıdır? A) Aktini · B) Fare primer antikorunu · C) Lazer ışığını · D) Kondansörü · E) Glikokaliksi
11. Floresan yayım ışığı uyarma ışığına göre genellikle nasıldır? A) Daha kısa dalga boylu · B) Aynı dalga boylu olmak zorunda · C) Daha uzun dalga boylu · D) Elektron demetidir · E) Görünmezliği zorunludur
12. Konfokal düzende pinhole’un ana işlevi nedir? A) Kesiti fiziksel olarak almak · B) Odak dışı sinyali azaltmak · C) Elektronu hızlandırmak · D) DNA’ya bağlanmak · E) Metal kaplama yapmak
13. Farklı derinliklerden optik kesitler alıp 3B dağılımı değerlendirmek için hangi düzen özellikle uygundur? A) Konfokal lazer · B) Yalnız çıplak göz · C) SEM · D) Basit oküler büyütmesi · E) Karanlık alan kondansörü
14. TEM’de elektronların güçlü saçıldığı yoğun alanların göreli görünümü nasıldır? A) Her zaman renkli · B) Daha koyu · C) Tamamen saydam · D) Yalnız yeşil · E) Kesinlikle ölçülemez
15. Hücre içi mikrovillus kesitini ve glikokaliksi en ince ayrıntıyla inceleme sorusunda hangi yöntem seçilir? A) SEM · B) TEM · C) Polarize ışık · D) Faz kontrast · E) Köhler ayarı
16. Yüzey çukurları ve çıkıntıları güçlü derinlik hissiyle görmek için hangi yöntem seçilir? A) TEM · B) İndirekt immünofloresans · C) SEM · D) Aydınlık alan · E) Göz muayenesi
17. İnverted mikroskobun temel yerleşim farkı hangisidir? A) Objektif örneğin altındadır · B) Elektron vakumu kullanır · C) Kesitleri otomatik boyar · D) Işık kullanmaz · E) İki analizörü vardır
18. Slayt 23’te listelenip sonraki slaytlarda ayrı ayrıntılı açıklanmayan teknik hangisidir? A) Faz kontrast · B) Floresans · C) İnterferans · D) Konfokal · E) Polarizasyon
19. TEM ile SEM ayrımının en sağlam ölçütü hangisidir? A) Görüntünün siyah beyaz oluşu · B) Temel sinyalin örnekten geçiş mi yüzeyden toplanma mı olduğu · C) Fotoğraf boyutu · D) Kullanıcının gözlüğü · E) Laboratuvarın aydınlığı
20. Slaytta DRAQ5 için tüm koşullarda “DNA küçük oluğuna bağlanır” demek neden sakıncalıdır? A) DNA boyası değildir · B) Yalnız aktine bağlanır · C) Bağlanma biçimi koşula göre değişebilir ve interkalasyon da gösterilmiştir · D) Sadece elektron mikroskobunda kullanılır · E) Hiç floresans vermez

Gerekçeli cevap anahtarı

1. B — Faz kontrast, boyasız saydam hücrenin optik yol farkını görünür kontrasta çevirir.
2. C — Toplam büyütme 5 × 40 = 200×’tir.
3. B — Oküler mevcut görüntüyü büyütür; objektifin çözmediği ayrıntıyı yeniden oluşturmaz.
4. B — Örnek odaklandıktan sonra alan diyaframı kapatılıp kenarı ayar işareti olarak kullanılır.
5. C — n, örnek ile objektif arasındaki ortamın kırılma indisidir.
6. C — Doğrudan ışık engellendiğinden saçılan ışıkla parlak sinyal oluşur.
7. D — 1 µm = 1000 nm olduğundan 0,2 µm = 200 nm’dir.
8. B — Analizör örnekten çıkan ışığı gözlem yolunda ikinci kez seçer.
9. A — Yöne bağlı parlaklık, optik anizotropinin işaretidir.
10. B — Anti-fare sekonder, farede hazırlanmış primer antikora bağlanır.
11. C — Fluorofor genellikle uyarma ışığından daha uzun dalga boyunda ışık yayar.
12. B — Pinhole odak dışı ışığın dedektöre ulaşmasını sınırlar.
13. A — Konfokal tarama farklı derinliklerden optik kesit dizisi üretebilir.
14. B — Daha çok saçılan alanlardan daha az elektron doğrudan geçer ve alan görece koyu görünür.
15. B — TEM çok ince kesitte hücre içi yüzey uzantılarını ve örtüsünü gösterir.
16. C — SEM yüzeyden gelen sinyali tarayarak topografik görüntü oluşturur.
17. A — Ters mikroskopta objektif örneğin altına yerleştirilir.
18. C — İnterferans yöntemi listelenir, fakat ayrı açıklayıcı slayt yoktur.
19. B — TEM’de geçiş, SEM’de yüzeyden toplanan sinyal temel farktır.
20. C — DRAQ5’in DNA’ya bağlanması tek, koşulsuz küçük oluk mekanizmasına indirgenemez.

Slayt notları, düzeltmeler ve kaynak haritası

Slayttaki öğretim üyesi Asım Savlu M.D., Histology and Embryology Department olarak verilmiştir. Slayt 2’deki kitaplar dersin önerdiği okuma kaynaklarıdır; aşağıdaki bağlantılar yalnız slayttaki belirsiz veya hatalı noktaları doğrulamak içindir.

• Slayt 15 ve 48 — çözünürlük sayıları: Slayt 15’te SEM için 0,2 nm, TEM için “0,05 nm theoretical” ve “1 nm tissue section”; slayt 48’de TEM için 1 nm yazılır. Bunlar tek bir cihaz ve örneğin tutarlı teknik özellikleri gibi okunmamalıdır. Gerçek çözünürlük cihaz, hızlandırma, örnek ve görüntüleme koşullarına bağlıdır. JEOL’un genel SEM karşılaştırması TEM için 0,1–0,3 nm, SEM için 0,5–4 nm aralıklarını; belirli TEM modelinin özellikleri ise cihaz ve mod bazlı sayıları verir. Slayt 48’deki “400 times more magnification” ifadesi de evrensel bir katsayı değildir: büyütme ile çözünürlük farklı ölçütlerdir; mikroskop objektifleri üzerine teknik açıklama bu ayrımı vurgular.
• Slayt 30 — tür adı: Görsel altındaki “Bacillus antharasis” yazımı, NCBI Taxonomy’deki Bacillus anthracis kaydı ile uyuşmaz. Görselin faz kontrast örneği oluşu değişmez.
• Slayt 41 — DNA boyalarının bağlanması: DAPI ve Hoechst için küçük oluk (minor groove) bağlanması uygun bir özet olabilir. Ancak slayt aynı mekanizmayı DRAQ5 ve DRAQ7 dahil tüm listedeki boyalara geneller. DRAQ5 üzerine deneysel çalışma düşük ve yüksek derişimde farklı bağlanma davranışları bildirdiğinden DRAQ5’i koşulsuz küçük oluk boyası saymak doğru değildir. Bu not DRAQ7 için ayrı bir mekanizma iddiası kurmaz.
• Slayt 44 — konfokal çözünürlük: Optik kesitlemenin sağladığı odak dışı sinyal azalması ve çözünürlük aynı özellik değildir. Slaytın TEM’e göre daha düşük çözünürlük karşılaştırması korunmuştur; konfokal optiğin geniş alan karşılaştırmasında pinhole ve arka planın rolü ayrıca açıklanır.